[摘要] 研究蒸制和烘制对附子生物碱含量的影响，采用UPLC-MS/MS方法，多反应监测模式（MRM）同时测定附子中13种生物碱成分的含量。结果表明蒸制过程中附子双酯型生物碱含量迅速降低，单酯型生物碱含量先升后降，于40 min时达到最高峰，原碱中乌头原碱、新乌头原碱、次乌头原碱快速增加，附子灵、宋果灵、多根乌头碱和去甲猪毛菜碱含量相对稳定或略有降低。烘制过程中生物碱成分的动态变化趋势与蒸制过程有明显差异，双酯型生物碱降解速度比蒸制稍慢，单酯型生物碱、原碱和总生物碱被不同程度破坏，含量显著低于同时间点蒸制附片。该研究揭示了附子蒸制或烘制过程中生物碱成分的动态变化规律，2种炮制方法均能有效去除毒性成分并保留有效成分，工艺简便易行，方法可控，具有推广和应用价值。

　　[关键词] 附子;生物碱;UPLC-MS/MS;炮制;变化规律

　　附子来源于毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛之功效，其“补火助阳之要药”地位被历代医家推崇。现代研究表明附子主要毒/效成分为生物碱，包括双酯型生物碱、单酯型生物碱、原碱等[1-2]，其中，双酯型生物碱为附子剧毒性成分，单酯型生物碱具有镇痛和抗炎等作用[3-4]，附子灵和宋果灵具有镇痛、降压作用[5]，次乌头原碱、新乌头原碱等原碱和去甲猪毛菜碱均有强心作用[6-7]。附子炮制可使双酯型生物碱水解转化为单酯型生物碱及原碱，发表文章减毒存效，其方法囊括炮、炒、煨、蒸、煮等数十种，2010年版《中国药典》收载的黑顺片、白附片、淡附片和炮附片，即是附子经过胆巴水浸制、煮、漂、蒸、晒等工艺加工炮制而成，然法定方法过程繁杂，可控性差，不同批次制附片中生物碱成分含量相差可高达10倍，有效成分流失严重，存在炮制过度之嫌[8-11]，且漂洗不彻底还可导致CaCl₂，MgCl₂等无机杂质的残留[12]。目前，已有文献报道了蒸制和烘制对附子6种酯型生物碱含量的影响[13]，本文进一步探讨附子直接蒸制或烘制方法的可行性，采用UPLC-MS/MS检测技术，研究13种主要生物碱成分的动态变化规律，以期为附子炮制提供简便可行的加工方法。

　　1 材料

　　Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），Agilent 6460型三重四极杆质谱仪（美国Agilent公司），Agilent Masshunter B.03.01 SP2工作站软件（美国Agilent公司），KQ-100超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），TDL80-2B台式离心机（上海安亭科学仪器厂），SYQ-DSX-280不锈钢压力蒸气灭菌器（上海申安医疗器械厂），DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），AUW220D型1/10万天平（日本岛津公司），Milli-Q纯水系统（美国Millipore公司）。

　　实验药材购于四川江油中坝附子科技发展有限公司，由四川省中医药科学院舒光明研究员鉴定，为乌头A. carmichaelii Debx.子根的加工品。氢溴酸高乌甲素（lannaconitine，批号100289-200902），苯甲酰次乌头原碱（benzoylhypaconine，批号111796-201002），苯甲酰新乌头原碱（benzoylmeaconine，批号111795-200901），苯甲酰乌头原碱（benzoylaconine，批号111794-200901），乌头碱（aconitine，批号110720-200410），新乌头碱（mesaconitine，批号110799-200505），次乌头碱（hypaconitine，批号110798-201106）对照品购自中国食品药品检定研究院;去甲猪毛菜碱对照品（salsolinol，批号1-LJM-177-1）购自Toronto Research Chemicals Inc;乌头原碱（aconine，批号must-11051501），宋果灵（songorine，批号must-12090504），多根乌头碱（karacoline，批号must-13021802），附子灵（fuziline，批号must-12090810）对照品购自成都曼思特生物科技有限公司;次乌头原碱（hypaconine），新乌头原碱（mesaconine）对照品由本实验室从制川乌中分得，HPLC峰面积归一化法分析，纯度均≥98.0%;乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

　　2 方法与结果

　　2.1 炮制加工方法与样品制备

　　湿热蒸制：取生附片6 kg，加适量水润透，分成6等份，置不锈钢压力蒸气灭菌器内，分别于120 ℃蒸10，20，40，60，90，120 min，晒干，即得蒸附片。

　　干热烘制：取生附片6 kg，分成6等份，置电热恒温鼓风干燥箱内，分别于150 ℃烘10，20，40，60，90，120 min，即得烘附片。

　　2.2 LC-MS/MS测定附子13种生物碱的含量

　　2.2.1 测定条件 液相条件：Agilent SB-C₁₈色谱柱（2.1 mm×20 mm，1.8 μm）;柱温35 ℃;流动相A为0.1%甲酸乙腈溶液，B相为2 mmol·L^-1乙酸铵溶液+0.1%甲酸;流速0.4 mL·min^-1;进样量1 μL。梯度洗脱：0～1.5 min，15%～20% A;1.5～5 min，20% ～70% A;5～5.1 min，70% ～100% A;5.1～8 min，100% A。

　　质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正离子模式下进行数据采集，毛细管电压4 kV，干燥气温度350 ℃，干燥气流速11 L·min^-1，雾化气压力310 kPa。13种生物碱及内标的主要质谱分析参数见表1，上述条件下所测定各成分的MRM图见图1。

　　2.2.2 对照品溶液及内标溶液的制备 精密称取13种对照品适量，分别置于25 mL量瓶中，加0.05 mol·L^-1盐酸溶液溶解定容到刻度，配置成每1 mL含乌头碱、苯甲酰乌头原碱、次乌头原碱、附子灵、宋果灵、多根乌头碱、去甲猪毛菜碱0.5 mg，新乌头原碱0.25 mg，乌头原碱0.05 mg，新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱1 mg的单标储备溶液。取各单标储备溶液1 mL至25 mL量瓶中，用0.05 mol·L^-1盐酸溶液定容到刻度，得混合对照品储备溶液。

　　精密称取氢溴酸高乌甲素对照品适量，用甲醇配制成质量浓度约为25 mg·L^-1的内标溶液。

　　2.2.3 供试品溶液的制备 取各样品粉未（过3号筛）约2 g，精密称定，精密加入0.05 mol·L^-1盐酸溶液50 mL，摇匀，超声提取30 min，冷却至室温，3 000 r·min^-1离心10 min，取上清液0.4 mL置10 mL量瓶中，加1 mL内标溶液，再加甲醇定容至刻度，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

　　2.2.4 线性关系及检出限、定量限 取上述混合对照品储备溶液，精确配制一系列不同质量浓度的混合对照品工作溶液，每个浓度各加入1 mL内标溶液，加甲醇定容至10 mL，即得。按2.2.1项下条件测定，以对照品进样量与内标进样量之比为横坐标，对照品峰面积与内标峰面积之比为纵坐标绘制标准曲线。最小浓度对照品工作溶液逐级稀释进样，以信噪比S/N为3∶1确定最低检出限，以信噪比S/N为10∶1确定定量限，结果见表2。

　　由表2和图1可知，13种生物碱在上述线性范围内线性关系良好，无干扰，仪器检出限及定量限能达到样品含量测定要求。

　　2.2.5 精密度试验 取生附片供试品溶液，重复进样6次，记录峰面积。结果去甲猪毛菜碱、新乌头原碱、多根乌头碱、乌头原碱、宋果灵、次乌头原碱、附子灵、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱定量离子峰与氢溴酸高乌甲素定量离子峰面积比值的RSD分别为1.9%，2.8%，1.6%，2.3%，1.8%，2.7%，0.80%，1.1%，2.0%，0.70%，1.2%，1.6%，1.4%，表明仪器精密度良好。

　　2.2.6 稳定性试验 取生附片供试品溶液，室温放置0，1，2，4，8，10，12，24 h后，按上述测定条件测定，记录峰面积。结果上述13种生物碱定量离子峰与氢溴酸高乌甲素定量离子峰面积比值的RSD依次为2.3%， 3.6%，1.8%，2.9%，2.2%，2.9%，1.3%，1.5%，2.3%，1.9%，1.8%，2.0%，1.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

　　2.2.7 重复性试验 取生附片约2 g，共6份，精密称定，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，精密吸取1 μL，注入液质联用仪，记录峰面积，计算含量。上述13种生物碱含量的RSD依次为3.1%，3.4%，1.5%，3.8%，2.0%，2.9%，1.4%，1.0%，2.1%，1.9%，1.2%，1.7%，1.7%，表明重复性良好。

　　2.2.8 回收率试验 取已知含量的生附片1 g，精密称定，共6份，准确加入与样品中含量相当的对照品溶液，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，测定，记录峰面积，计算回收率。结果上述13种生物碱平均回收率依次为86.4%，96.6%，95.3%，96.4%，94.9%，93.2%，99.0%，95.1%，98.9%，95.6%，94.2%，101%，96.2%，RSD分别为0.90%，1.3%，1.8%，4.4%，1.2%，1.9%，1.7%，3.3%，4.2%，2.6%，1.5%，1.0%，2.6%。

　　2.2.9 含量测定 取各附片样品，按2.2.3项下方法操作，每个批次样品制备3份供试品，进样，测定峰面积，内标法计算，结果见表3，4。
　　3 结论

　　本研究首先对蒸制和烘制的温度、时间条件进行了预实验比较研究，确定蒸制、烘制的温度分别为120，150 ℃，炮制时间分别选择10，20，40，60，90，120 min，得到12批制附片样品，采用LC-MS/MS技术测定各样品中13种主要生物碱成分的含量。研究结果表明（表3，4）：蒸制过程中，双酯型生物碱含量迅速降低，20 min时蒸附片中3种双酯型生物碱的总量就已低于0.020%，即符合2010年版《中国药典》附子双酯型生物碱检查项下的规定;单酯型生物碱含量先升后降，约在40 min达到最大值，该时段以双酯型生物碱水解转化为单酯型生物碱为主，此后含量缓慢降低，以单酯型生物碱水解转化为原碱为主。蒸制过程中，乌头原碱、新乌头原碱、次乌头原碱含量一直呈现快速增加趋势，120 min时达最高峰，约为生附片含量的10～20倍，系酯型生物碱不断水解转化所致，而附子灵、宋果灵、多根乌头碱和去甲猪毛菜碱含量相对稳定或略有降低。与蒸制过程比较，烘制条件下双酯型生物碱降解速度稍慢，约40 min时达到药典标准（不得过0.020%）;单酯型生物碱变化规律虽与蒸制相似，但3种单酯型生物碱的总量明显低于蒸附片，约为蒸附片的50%～70%。有趣的是各批烘附片中乌头原碱、新乌头原碱、次乌头原碱含量相当、变化不大，约为生附片含量的2倍，极显著低于蒸附片;而附子灵、宋果灵、多根乌头碱和去甲猪毛菜碱随烘制时间的增加含量逐渐降低，提示该4种成分长时间烘制不稳定。综上分析可见，蒸制和烘制过程中生物碱成分的动态变化规律有明显差异，蒸附片中单酯型生物碱、原碱和总生物碱的含量明显高于烘附片，但双酯型生物碱含量低于烘附片，表明附子炮制方法不同，生物碱转化方式和程度可能不同，从化学成分角度诠释了附子不同炮制品的临床功效和应用方向可能不同。

　　文献报道[8-11]，附子用胆巴水浸制、煮、漂、蒸等处理，总生物碱下降为原生药的1/6～1/9，损失率达80%以上，原碱相当于原生药的1/100左右，毒性生物碱和强心成分流失严重，以致毒性减弱，疗效也随之降低，存在炮制过度之嫌，正如张景岳所说：“制之太过，则但用附子之名耳，效与不效无以应验，今人只知附子之可畏，而不知太熟之无用”。基于上述研究结果，作者认为生附子直接采用湿热蒸制或干热烘制，能有效去除毒性成分双酯型生物碱，达到药典要求，同时很好地保留了药效成分单酯型生物碱、原碱和去甲猪毛菜碱等，且不含胆巴（无胆附片），生产工艺简便易行，方法可控，具有推广和应用价值，建议《中国药典》增加附子无胆炮制方法。